均一性與穩(wěn)定性控制

佐劑（Adjuvant）又稱免疫調(diào)節(jié)劑或免疫增強(qiáng)劑（Immunepotentiator），是作為疫苗的一種添加劑，當(dāng)它先于抗原或與抗原混合注入機(jī)體后，能夠增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答或者改變免疫反應(yīng)的類型，屬于非特異性的免疫增強(qiáng)劑，而其本身無抗原性。理想的佐劑不僅能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)，而且能使機(jī)體獲得最佳的保護(hù)性免疫。乳佐的均一性和穩(wěn)定性是非常重要的兩個考察項，而與此直接相關(guān)的是粒度的控制¹。

最近發(fā)布在Nature的文章表明，對MF59而言，平均粒徑在160nm（MF59）左右效果比較佳²，粒徑過大及過小效果都欠佳。此外，小顆粒濃度（如＜100nm）及大顆粒濃度（如＞1.2μm）過高均影響最后的藥效且?guī)砀弊饔梦：?。因此，除對平均粒徑控制外?ldquo;過大”，“過小”顆粒濃度控制也非常重要。值得注意的是，在實際應(yīng)用中，產(chǎn)品穩(wěn)定性指標(biāo)是一個非常重要的考察項，用于快速篩選配方及優(yōu)化工藝。

乳佐流程概述

乳佐的常規(guī)制備方法為：制備水相、油相，經(jīng)過混合、剪切步驟形成初乳，初乳經(jīng)微射流均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，而后除菌過濾得到乳佐。初乳、均質(zhì)后乳液、除菌過濾后乳液通過PSS的Nicomp粒度分析儀測試平均粒徑、AccuSizer顆粒計數(shù)器測試過大顆粒濃度、Lum穩(wěn)定性分析儀快速篩選乳佐配方穩(wěn)定性。另通過Lumispoc檢測過小顆粒濃度。

圖2 乳佐制備及應(yīng)用關(guān)鍵點

乳佐粒度控制

以MF59為例，國際廠家在其乳佐制備上，對粒徑進(jìn)行嚴(yán)格控制，控制初乳、微射流均質(zhì)后乳液、除菌過濾后乳液的平均粒徑及大于1.2μm的油滴濃度^3,4。

高壓微射流均質(zhì)機(jī)

PSI-20高壓微射流均質(zhì)機(jī)（小試兼中試型）采用固定結(jié)構(gòu)的均質(zhì)腔，通過電液傳動的增壓器使物料在高壓作用下以極大的速度流經(jīng)交互容腔的微管通道，物料流在此過程中受到高剪切力、高碰撞力、空穴效應(yīng)等物理作用，使得平均粒徑降低、體系均一穩(wěn)定，由此獲得理想的均質(zhì)、分散或乳化結(jié)果。

平均粒徑檢測

乳佐的粒度對其免疫效果起到很大的作用，整體平均粒徑過大過小都不利于乳佐的免疫效果，以MF59為例，一般平均粒徑在160nm 左右效果比較佳。其平均粒徑不宜過大，相比于微米級別的液滴，納米級別的乳佐更易于無菌過濾，耐受性良好，比更大的微米級W/O乳液佐劑具有更好的免疫原性和穩(wěn)定性。但平均粒徑過小，則會降低其在肌肉中的停留時間，導(dǎo)致從注射部位排除更快地排除，從而降低了藥物效果，因為較小的顆粒比較大的顆粒更容易通過細(xì)胞內(nèi)間隙外滲，并更快地到達(dá)淋巴結(jié)。因此，平均粒徑需在合適范圍內(nèi)。

Nicomp納米激光粒度儀系列

Nicomp系列納米激光粒度儀采用動態(tài)光散射原理檢測分析樣品的粒度分布，基于多普勒電泳光散射原理檢測ZETA電位。

小粒子和尾端大粒子濃度檢測

乳佐常規(guī)的平均粒徑一般為亞微米級別或納米級別，但是微米的乳粒往往大量存在，這些尾端大粒子的存在往往會吸附小顆粒，影響乳佐的穩(wěn)定性，分析尾端大粒子濃度和數(shù)量，可以評價當(dāng)前配方和工藝的情況并做出相應(yīng)的優(yōu)化。USP729規(guī)定乳劑中大于5μm的乳粒(PFAT5)體積占比不得超過0.05%，但目前還未有藥典對乳劑中的下限進(jìn)行規(guī)定，這并不意味著小粒子無需關(guān)注。如果過小顆粒濃度過多，如低于100nm，幾十納米左右，那么注入體內(nèi)后可以穿過人體內(nèi)大部分細(xì)胞屏障，到達(dá)的人體部位更多更廣，由此造成的毒副作用會增加。

AccuSizer顆粒計數(shù)器系列

AccuSizer系列在檢測液體中顆粒數(shù)量的同時精確檢測顆粒的粒度及粒度分布，通過搭配不同傳感器、進(jìn)樣器，適配不同的樣本的測試需求，能快速而準(zhǔn)確地測量顆粒粒徑以及顆粒數(shù)量/濃度。

LumiSpoc 單粒子顆粒計數(shù)器

LumiSpoc采用單粒子光散射技術(shù)（SPLS），通過在光學(xué)流通池中進(jìn)行流體動力聚焦，將單個粒子排列成一條直線。通過調(diào)整流動條件來調(diào)整樣品濃度，從而避免濃度峰值的影響。當(dāng)單個納米或者微米顆粒經(jīng)過特殊光束截面的激光束時，記錄其正向和側(cè)向散射的光強(qiáng)。根據(jù)米氏理論，將分類強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為粒度分布密度。通過軟件分析顯示計數(shù)分布、顆粒濃度。在行業(yè)內(nèi)已有使用Lumispoc用于顆粒濃度的監(jiān)測成功案例

穩(wěn)定性分析檢測

穩(wěn)定性是評估藥物的常規(guī)項，乳佐穩(wěn)定性影響存放時間和有效期，穩(wěn)定性較差的乳佐不僅會增加運輸儲存成本，還有可能增加用于人體使用的風(fēng)險。在乳佐制備中，控制尾端大粒子數(shù)量和濃度能使乳佐更為穩(wěn)定，國外某公司重點強(qiáng)調(diào)了＞1.2μm的液滴濃度 ，因為這部分液滴濃度過高，會凝聚或者聚結(jié)，從而導(dǎo)致乳液不穩(wěn)定。

LUM穩(wěn)定性分析儀

Lum穩(wěn)定性分析儀可以直接測量整個樣品的分散體的穩(wěn)定性，檢測和區(qū)分各種不穩(wěn)定現(xiàn)象，如上浮、絮凝、聚集、聚結(jié)、沉降等，通過測量結(jié)果可用來開發(fā)新的配方和優(yōu)化現(xiàn)有的配方及工藝。

過濾

微射流處理后的乳液經(jīng)過適當(dāng)?shù)臑V芯過濾工藝。過濾可去除前置工藝流程中的大油滴，這部分油滴雖然數(shù)目很少，但這些油滴體積占比較大，且極易成為聚集的成核位點，吸附更多的小液滴，導(dǎo)致儲藏過程中乳液穩(wěn)定性降低。濾膜的材質(zhì)將影響過濾后的效果，綜合考量物理攔截，吸附攔截等效果，選擇適配的濾膜材質(zhì)用于過濾，此外，還需結(jié)合乳液配方考慮相容性穩(wěn)定。 

Entegris-ANOW 濾芯

Entegris-Anow是一家高分子微孔膜過濾企業(yè)，專業(yè)從事MCE、Nylon、PES、PVDF、PTFE等（膜孔徑為0.03μm~10μm）微孔膜的研發(fā)及生產(chǎn)，具有二十多年服務(wù)與醫(yī)藥客戶經(jīng)驗，并為生物制藥、醫(yī)療器械、食品飲料、實驗室分析、微電子及工業(yè)等領(lǐng)域的客戶提供過濾、分離和凈化解決方案。

Entegris與Anow的結(jié)合，引入Entegris質(zhì)量管理體系，每一支濾芯都經(jīng)過嚴(yán)格檢查，此外，新建成的CTC驗證中心，為客戶提供專業(yè)的驗證服務(wù)。